**印跡檢測法（Western blotting）,又稱蛋白質(zhì)印跡，是分子生物學、生物化學和**遺傳學等生命科學研究中常用的的一種實驗方法，其基本原理是通過 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分待測樣品不同的組分，再在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上，通過特異性抗體作為探針，對靶抗原蛋白質(zhì)進行檢測，通過分析特異性反應的位置和強度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或（和）組織中表達情況的信息。
一、 基本原理 Western blotting 實驗通常由 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白質(zhì)的印跡和檢測兩個部分組
成。
**部分：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
1、 蛋白質(zhì)的電泳分離是指帶電粒子在電場作用下,向著與其所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象，各種蛋白質(zhì)因所帶的凈電荷、分子量大小和形狀不同而有不同的遷移率。聚丙烯酰胺凝膠（PAG）是由丙烯酰胺單體（Acr）和交聯(lián)劑****丙烯酰胺（Bis）在催化劑過硫酸銨作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。如果在電泳體系加入十二烷基硫酸鈉（SDS），則電泳遷移率主要依賴于分子量，與所帶的凈電荷和形狀無關。這種電泳方法稱為 SDS-PAGE，主要用于測定蛋白質(zhì)亞基分子量。
2、 電泳啟動后，蛋白樣品先在濃縮膠中運動，由于濃縮膠孔徑大，蛋白質(zhì)運動受阻小，因此不同的蛋白質(zhì)就濃縮到分離膠之上層，全部蛋白質(zhì)處于同一起跑線上。當?shù)鞍踪|(zhì)進入分離膠時，因單位質(zhì)量帶負電荷多者遷移快，反之則慢，即分子量小的蛋白遷移快，分子量大的蛋白遷移慢；由于分離膠孔徑小，而且成為一個整體的篩狀結(jié)構(gòu)，它們對大分子阻力大，小分子阻力小，因而蛋白質(zhì)在電泳過程中*終達到彼此分開。
3、 由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過的可移動樣品蛋白質(zhì)的分子量也不同。選擇一定的凝膠濃度，即選擇合適的凝膠孔徑，可使待分離樣品蛋白質(zhì)的泳動速率差異*大，得到*佳分離效果。通常根據(jù)被分離蛋白質(zhì)的分子量范圍選擇凝膠濃度
**部分：蛋白質(zhì)的印跡和檢測蛋白質(zhì)的印跡和檢測包括五個步驟：
轉(zhuǎn)膜→封閉→孵育一抗→孵育二抗→蛋白檢測（顯色）和分析
1、 轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)印跡首先是要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（膜）上，
即轉(zhuǎn)膜。*常用的固相載體（膜）主要是硝酸纖維素（NC）膜和聚偏二氟乙烯（PVDF）
膜。硝酸纖維素（NC）膜與蛋白質(zhì)之間靠疏水作用結(jié)合，無需預先活化，對蛋白質(zhì)的活性影響小；非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便。但結(jié)合在NC 上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時易丟失；NC韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜與蛋白質(zhì)
親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電荷蛋白結(jié)合。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45 μ m 和0.2 μ m 兩種規(guī)格的NC 膜。大于20 KD 的蛋白可用0.45 μ m 的膜，小于20 KD 的蛋白就要用0.2μ m 的膜。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分 子量蛋白的檢測。 常用的轉(zhuǎn)膜方式分為半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)兩種。 半干轉(zhuǎn)即將裝有凝膠、膜和濾紙的“三明治”的凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因為電流直接作用在膜和凝膠上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴格，但其轉(zhuǎn)移時間短，效率高。 濕轉(zhuǎn)即將裝有凝膠、膜和濾紙的“三明治”的凝膠夾層組合卡在轉(zhuǎn)移槽內(nèi)，垂直懸浮在緩沖液中，利用與凝膠夾層平行的電極板的高強度電場將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上。其優(yōu)點是可以對蛋白質(zhì)進行有效轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時間可適當延長獲得更完全的轉(zhuǎn)移，且可以同時轉(zhuǎn)移幾塊膠的蛋白質(zhì)。
2、	封閉 轉(zhuǎn)移成功后的膜上有很多非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點，為防止這些位點與抗體結(jié)合引起非特異的染色和背景，一般用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點來降低抗體的非特異性結(jié)合。封閉劑應該封閉所有未結(jié)合位點而不替換膜上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白的表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。*常見的封閉劑是BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和Tween-20，緩沖溶液是TBS或PBS。 惰性蛋白質(zhì)BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠或非離子去污劑Tween-20封閉膜上的未結(jié)合位點可以降低抗體的非特異性結(jié)合。Tween-20這種非離子型去污劑在乳化蛋白時，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，可減少對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞。 封閉劑選擇： a 脫脂奶是*常用的經(jīng)濟配方 b 脫脂奶粉不能與生物素化的抗體一起使用，因為脫脂奶粉含有糖蛋白和生物素；建議使用BSA。 c 分析磷酸化蛋白須用BSA。脫脂奶粉含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因為磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化;也不適用于堿性磷酸酶(AP)檢測系統(tǒng)。 d 如果用辣根過氧化物酶(HRP)檢測系統(tǒng)，封閉液不應加疊氮鈉(NaN3)，因為疊氮鈉對辣根過氧化物酶（HRP）有滅活作用。 e 如果用二抗抗體是堿性磷酸酶(AP)標記的檢測系統(tǒng)，可使用酪蛋白封閉，同時須選擇TBS緩沖溶液，不可使用PBS緩沖溶液，因為PBS緩沖溶液干擾堿性磷酸酶。 3、 孵育一抗檢測目標蛋白質(zhì)的特異性一抗抗體和封閉后的膜進行孵育，膜上的目標蛋白質(zhì)和一 抗抗體發(fā)生特異性的結(jié)合。 在**印跡實驗中，一抗抗體應該提前選定。一抗抗體取決于被檢測的抗原蛋白質(zhì)。**印跡一抗抗體包含單克隆抗體(MAbs)和多克隆抗體(PAbs)。單克隆抗體(MAbs)識別單個抗原表位,具有更高的特異性,可有效降低背景;但如果所識別的抗原表位被破壞，則會影響實驗結(jié)果。 多克隆抗體可識別多個抗原表位，通常具有更高的親和力，即使有少數(shù)幾個抗原表位被破壞，仍然不會影響實驗結(jié)果。
4、 孵育二抗特異性酶標記的針對一抗抗體的二抗抗體和孵育一抗后的膜進行孵育，膜上已和目 標蛋白質(zhì)特異性的結(jié)合的一抗抗體和二抗抗體發(fā)生特異性的結(jié)合。 大多數(shù)一抗抗體的來源是小鼠或兔，因此抗鼠**球蛋白和抗兔**球蛋白是*常見的二抗抗體。山羊是*常見的用于生產(chǎn)多克隆抗小鼠和抗兔抗體的動物，所以山羊抗鼠**球蛋白和抗兔**球蛋白是*常見的二抗抗體。選擇二抗抗體取決于一抗抗體的動物來源。例如,如果一抗抗體是小鼠來源單克隆抗體,二抗抗體必須是抗小鼠的抗體；如果一抗抗體是兔來源多克隆抗體,二抗抗體必須是抗兔的抗體。 5、 蛋白檢測（顯色）和分析（1）蛋白檢測（顯色）：
酶標記的二抗和合適的底物發(fā)生反應，生成有顏色的產(chǎn)物，即可見的蛋白區(qū)帶，通過分析特異性反應生成的可見蛋白區(qū)帶的位置和強度即可獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或（和）組織中表達情況的信息。 在酶標二抗抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶(HRP)。堿性磷酸酶可以將無色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍色的產(chǎn)物；而辣根過氧化物酶可以H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?-氯萘酚氧化成藍色產(chǎn)物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強化學發(fā)光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol，氨基苯二酰一肼）并發(fā)光，在化學增強劑存在下光強度可以增大1000 倍，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。 （2）結(jié)果分析：a對照設計 成功進行Western Blot 檢測，設置合適正確的對照是必不可少的，只要正確設置了這些對照，即可快速和準確的找到Western Blot 的問題所在，并保證實驗結(jié)果的準確性和特異性。 一般需要設置的對照如下：陽性對照：明確表達檢測蛋白的組織或細胞，用于檢測抗體的工作效率。 陰性對照：明確不表達檢測蛋白組織或細胞，用于檢測抗體的特異性。二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性。 內(nèi)參對照：檢測標本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)。 空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果。 b內(nèi)參內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的 蛋白，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting 中使用內(nèi)參其實就是在**印跡過程中另外用內(nèi)參對應的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達，由于內(nèi)參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準確性。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western Blotting 顯色或者發(fā)光體系是否正常。 選擇內(nèi)參與要檢測的目的蛋白的分子量*好相差5KD以上。當目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯，可同時進行檢測；當目的蛋白 的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體檢測，然后使用印跡膜再生液洗掉膜上的抗體，重新進行內(nèi)參蛋白的抗體檢測。
